摘要：以梵净山石斛成熟的蒴果为外植体， 研究不同培养基、激素浓度处理对梵净山石斛种子萌发、原球茎增殖、不定芽分化与生根的影响。结果表明， 梵净山石斛无菌播种最佳的培养基为KN 6-BA 0.5 mg·L-1 NAA0.5 mg·L-1 10%CM AC 1.0 g·L-1, 萌发率达到95.5%;原球茎增殖最优培养基为B5 6-BA 1.0 mg·L-1 NAA0.1 mg·L-1 AC 0.5 g·L-1;筛选出不定芽分化最适培养基为1/2MS 6-BA 0.5 mg·L-1 NAA 0.2 mg·L-1 10%土豆泥 AC 2.0 g·L-1, 不定芽增殖最适培养基为1/2MS 6-BA 2.0 mg·L-1 NAA 0.2 mg·L-1 10%土豆泥 AC2.0 g·L-1;小苗生根适宜的培养基为1/2MS NAA 0.5 mg·L-1 10%土豆泥 AC 2.0 g·L-1.
关键词：梵净山石斛； 种子萌发； 继代增殖； 组织培养；
梵净山石斛 （Dendrobium fanjingshanense） 为兰科石斛属多年生草本植物， 是2001年在贵州省梵净山黑湾河海拔800~1 500 m处发现的一个新种[1].自发现之时起， 一直被认为是贵州特有药用植物之一[2].直到2010年， 叶喜阳等[3]在浙江九龙山国家级自然保护区内也发现了梵净山石斛的分布。九龙山国家级自然保护区是目前浙江省唯一一处记载梵净山石斛分布的区域。梵净山石斛是一种珍稀名贵的中草药， 性味甘淡微咸， 寒， 归胃、肾， 主要用于治疗口干、烦渴、热病伤津、肺热干咳、腰膝软弱、阴伤目暗等病症[4].另外， 其花黄褐色或橙黄色， 也可作观赏植物， 具有较高的观赏价值。因而导致了大规模的采挖和频繁发生非法出口， 目前正面临着濒危的状态， 然而靠传统的分株繁殖方式， 很难起到保育作用。由于梵净山石斛种子微小， 胚胎发育不完全， 在自然条件下种子通常要与真菌共生才能萌发， 造成其种子发芽极为困难。因此采用无菌播种技术为梵净山石斛快速繁殖及开发利用提供技术服务。
1、材料与方法
1.1 材料
以梵净山石斛开花2 d后进行自交授粉120 d的蒴果为试验材料。
1.2 方法
1.2.1 外植体消毒灭菌
将梵净山石斛的蒴果用流水冲洗2 h后， 在超净工作台上用质量分数75%的酒精浸泡30 s, 再然后用无菌水冲洗3次， 再用质量分数0.1%Hg Cl2消毒10~12 min, 最后用无菌水冲洗5次。
1.2.2 种子萌发培养基的选择
将处理好的蒴果放在无菌操作台上的培养皿中， 先切除两端 （0.5 cm） , 然后把蒴果切开， 均匀地洒在MS、1/2MS、B5、KN和花宝1号培养基中， 附加6-BA和NAA各0.5 mg·L-1, 以及10%椰汁 （CM） , 活性炭 （AC） 含量为1.0 g·L-1, 蔗糖质量浓度为30 g·L-1, 琼脂为6.8 g·L-1.随时观察萌发情况， 60 d后统计萌发率和生长情况。
1.2.3 原球茎增殖培养基筛选
将萌发培养基上的原球茎转入到增殖培养基上， 采用L16 （45） 的正交试验设计设置不同基本培养基 （1/2MS、KC、B5、VW） 、6-BA浓度 （1.0、2.0、3.0、4.0 mg·L-1） 、NAA浓度 （0、0.1、0.5、1.0 mg·L-1） 、AC含量 （0、0.5、1.0、2.0 g·L-1） 等4个因素对梵净山石斛增殖的影响， 40 d后统计增重并计算增殖倍数。
1.2.4 原球茎分化与丛生芽增殖
将增殖的原球茎转接入基本培养基1/2MS中， 添加6-BA浓度 （0.1、0.5、1.0 mg·L-1） 和生长素NAA浓度 （0.1、0.2、0.5 mg·L-1） 组合的芽诱导培养基， 培养基中AC含量为2 g·L-1、蔗糖质量浓度30 g·L-1、琼脂6.8 g·L-1, 每个组合培养基为10瓶， 每瓶10个原球茎， 30 d后统计分化芽数及生长情况， 60 d后统计丛生芽数并计算增殖系数。
1.2.5 生根诱导
待丛生芽长至2 cm高时转接入1/2MS培养基， 分别添加不同浓度的NAA （0.5、1.0、2.0 mg·L-1） 和IBA （0.2、0.5、1.0 mg·L-1） 到生根诱导培养基中， AC含量为2 g·L-1, 蔗糖质量浓度为30 g·L-1, 琼脂7.7 g·L-1.每个组合培养基为10瓶， 每瓶2~3个分化小芽， 每隔3~4 d观察培养基中的情况， 30 d后统计生根率、观察根系生长状况。
1.2.6 培养条件
培养室环境的温度为 （22±2） ℃， 光照强度为2 000 lx, 日光照时间为12 h.
2、结果与分析
2.1 种子萌发
将梵净山石斛的种子接到为MS、1/2MS、KN、B5、花宝1号及附加BA、NAA浓度为0.5 mg·L-1的萌发培养基上， 观察种胚萌发率和生长差异较大。种子接入培养基20 d后， 在培养基KN 6-BA0.5 mg·L-1 NAA 0.5 mg·L-1 10%CM AC2.0 g·L-1上可见到白色圆球茎；60 d后， 原球茎由白转绿， 出现芽苗。
由表1可见， 供试种子在不同培养基上萌发程度不同。以KN 6-BA 0.5 mg·L-1 NAA 0.5 mg·L-1 10%CM AC 1.0 g·L-1培养基上效果最优， 萌发率可达95.5%;在培养基B5 6-BA 0.5 mg·L-1 NAA 0.5 mg·L-1 10%CM AC 1.0 g·L-1中萌发效果差， 萌发率仅有85.6%;在花宝1号 6-BA 0.5 mg·L-1 NAA 0.5 mg·L-1 10%CM AC 1.0 g·L-1培养基中， 萌发率可达93.3%, 可见培养基的盐分组合与盐浓度是影响种子萌发的因素之一， 不同的盐分组合与高浓度盐成分可能会抑制梵净山种子萌发， 在培养基中附加椰汁与活性炭有助于种子的萌发。
表1 不同培养基对种子萌发的影响
注： （ ） 表示原球茎少， （ ） 表示原球茎较多， （ ） 表示原球茎多。
2.2 原球茎增殖
不同基本培养基、植物激素的种类与配比浓度及添加物共同使用对原球茎增殖有重要作用。由表2可知， 在极差分析中， 培养基类型对原球茎增殖影响最大， 其次是AC含量。由此可见， 各因素对梵净山石斛原球茎增殖的影响程度依次是培养基类型>AC含量>6-BA>NAA.根据K值大小及培养基类型， 6-BA和NAA浓度， 以及AC含量各因素水平间的比较， 得出原球茎增殖的最优培养基为B5 6-BA 1.0 mg·L-1 NAA 0.1 mg·L-1 AC 0.5 g·L-1.
2.3 丛生芽分化与增殖
将增殖后的原球茎转接到培养基C1~C9中， 诱导不定芽分化与增殖。表3结果表明， 最适合梵净山石斛不定芽分化的培养基为1/2MS 6-BA0.5 mg·L-1 NAA 0.2 mg·L-1 10%土豆泥 AC 2.0 g·L-1, 分化芽数达1.6个， 随着6-BA浓度的升高， 不定芽的分化呈下降趋势， 说明低浓度的6-BA对不定芽的分化有促进作用。不定芽增殖培养基为1/2MS 6-BA 2.0 mg·L-1 NAA 0.2 mg·L-1 10%土豆泥 AC 2.0 g·L-1, 而随着6-BA浓度的升高， NAA浓度的降低， 不定芽增殖系数呈上升趋势。
2.4 生根诱导
待丛生芽长至2 cm高时转接入1/2MS培养基， 附加10%土豆泥， AC含量2.0 g·L-1.在此基础培养基上， 添加不同浓度的生长素NAA或IBA的生根诱导培养基 （D1~D6） .培养30 d后发现， 在茎基部开始长出较细的不定根， 约2个月后即可获得根系发达， 生长旺盛的完整植株 （表4） .
表2 不同培养基对原球茎增殖的影响
表3 不同浓度的BA、NAA对不定芽分化与增殖的影响
表4 不同浓度NAA、IBA对不定芽生根诱导的影响
选用不同的生长素种类与浓度因不同植物而定， 只有满足植物生根所需的激素浓度与配比， 才能提高生根率和成活率。在各激素处理中， 以NAA低浓度 （0.5 mg·L-1） 处理对梵净山石斛的生根效果最好；而IBA浓度 （0.2 mg·L-1） 处理对梵净山石斛苗生根生长的效果最差。说明高浓度NAA不利于梵净山石斛的生根， 因此在梵净山石斛生根过程中添加0.5 mg·L-1NAA是较适宜的， 附加土豆泥和活性炭对组培苗生根有促进作用。
3、小结与讨论
梵净山石斛由于具有较高的观赏价值与经济价值， 因而广受欢迎。目前采用无菌播种方法生产种苗是解决种苗短缺一种快速有效的途径。由于无菌播种生产的种苗后代不一致， 稳定性差， 因此在采用无菌播种进行梵净山种苗生产时， 要对父母本进行严格选择， 以确保后代性状尽可能一致。
梵净山石斛在组培中对激素种类、浓度和营养状况的要求较高， 适宜的激素配比可大大提高梵净山石斛的快速繁殖能力。基本培养基、植物激素的种类与配比浓度及添加物组合使用对梵净山石斛组织培养过程中种子萌发、原球茎诱导、增殖、不定芽分化与增殖以及生根诱导等方面产生重要的影响[6-10].在种子萌发阶段， KN基本培养基无机盐含量较低， 能满足种子萌发所需的矿物营养， 而高浓度的矿物营养会影响种子萌发， 故采用KN 6-BA 0.5 mg·L-1 NAA 0.5 mg·L-1 10%CM AC 1.0 g·L-1培养基效果较为理想， 种子萌发率可达95.5%, 且萌发多成团状。在原球茎增殖阶段， 培养基类型对原球茎增殖影响最大， 其次是AC含量。由此可见， 各因素对梵净山石斛原球茎增殖的影响程度依次是培养基类型>AC含量>6-BA>NAA, 得出较优培养基为B5 6-BA 1.0 mg·L-1 NAA 0.1 mg·L-1 AC 0.5 g·L-1;在不定芽分化与增殖培养中， 6-BA浓度对梵净山石斛原球茎分化与不定芽增殖也有重要的影响， 其中以低浓度6-BA对不定芽的分化有促进作用， 而不定芽的增殖随着6-BA浓度的升高增殖系数呈上升趋势， 因此筛选出1/2MS 6-BA 0.5 mg·L-1 NAA0.2 mg·L-1 10%土豆泥 AC 2.0 g·L-1培养基分化芽数较高， 为1/2MS 6-BA 2.0 mg·L-1 NAA 0.2 mg·L-1 10%土豆泥 AC 2.0 g·L-1培养基能有效提高其增殖系数。梵净山石斛生根过程添加NAA为0.5 mg·L-1是较适宜的， 附加土豆泥和活性炭能促进组培苗生根。因而采用组培快繁技术使梵净山石斛野生资源得到保护从而进一步开发利用， 推进其保育工作。
参考文献
[1]金效华， 张玉武， 肖丽萍。中国石斛属一新种[J].植物分类学报， 2001, 39 （3） :269-271.
[2]孙济平， 何顺志。贵州特有药用植物的种类及分布[J].中国中药杂志， 2005, 30 （10） :735-738.
[3]徐文芬， 黄敏， 何顺志。贵州兰科药用植物新资源调查[J].贵州农业科学， 2012, 40 （8） :18-21.
[4]叶喜阳， 吴棣飞， 李根友， 等。浙江2种种子植物新记录[J].浙江林学院学报， 2010, 27 （3） :478-479.
[5]袁正仿， 张卫明， 丁小余， 等。铁皮石斛的组织培养研究[J].中国医学生物技术应用杂志， 2002 （3） :58-60.
[6]李荣珍。铁皮石斛种子试管苗的快速繁殖研究[J].广东农业科学， 2012 （14） :22-24.
[7]曾万勇， 李金华， 王智， 等。铁皮石斛无菌萌发及小苗快繁培养条件研究[J].武汉工业学院学报， 2012 （3） :10-12, 47.
[8]宋顺， 许奕， 林妃， 等。铁皮石斛兰种子萌发及其原球茎的快繁培养条件研究[J].安徽农业科学， 2013, 41 （21） :8850-8852.
[9]张桂芳， 关杰敏， 黄松， 等。铁皮石斛原球茎的诱导与增殖影响因素研究[J].中药材， 2011, 34 （8） :1172-1177.
[10]王丽萍， 梁淑云。铁皮石斛原球茎诱导与增殖研究[J].中国农学通报， 2010, 26 （1） :265-268.