克拉霉素对预收缩小鼠气管的舒张作用

　　摘    要：　由于空气环境质量的下降，各种气道反应性疾病的发病率呈逐年上升趋势，寻找有效的支气管扩张剂尤为重要．为研究克拉霉素分散片对气管的舒张作用，以小鼠气管环为实验对象，通过离体组织恒温灌流系统和生物机能实验系统检测克拉霉素分散片在不同条件下对收缩气管环的舒张效果．结果表明克拉霉素分散片能引起预收缩的小鼠气管环产生浓度依赖性舒张，并能增强硝苯地平和Y27632对预收缩气管的舒张作用，其主要通过调控L型钙离子通道和钙敏感通道来发挥作用．由此可见，克拉霉素分散片可以作为一种潜在的新型而有效的支气管扩张剂．

　　关键词：　克拉霉素分散片; L型钙通道; 钙敏感通道; 气管环;

　　Abstract：　Due to the decline of air environmental quality, the incidence of various airway responsiveness disease is increasing year by year, and it is particularly important to find effective bronchodilator. To study the relaxation effect of clarithromycin dispersible tablets on trachea, mouse tracheal rings were used as the experimental materials and the relaxation effect of clarithromycin dispersible tablets on contractile tracheal rings in different conditions was tested by the isolated tissue thermostatic perfusion system and biological functional experiment systems. The results showed that the clarithromycin dispersible tablets induced concentrationdependent relaxation of the pre-contracted mouse tracheal rings, and could enhance the relaxation of nifedipine and Y27632 on pre-contracted tracheal rings, which were mainly by regulating L-type calcium channels and calcium sensitive channel. Therefore, clarithromycin dispersible tablets can be used as a potential and effective bronchodilator.

　　Keyword：　clarithromycin dispersible tablets; L-type calcium channels; calcium sensitive channels; tracheal rings;

　　近年来，由于空气环境质量的下降，各种气道反应性疾病，如不典型性哮喘、支气管哮喘、慢性咳嗽等成为呼吸系统的常见疾病，发病率呈逐年上升趋势[1,2]．这些疾病严重影响患病者健康状态及日常生活质量，目前已成为公共卫生性问题并备受关注．因此，我们亟需寻找一些有效的支气管扩张剂来解决这一难题[3]．目前，一些传统的草药和西药因具有较好的舒张气管的疗效而被广泛用于治疗哮喘和慢性阻塞性肺病[4,5]，但是药物单独使用时舒张效果或者安全性不甚理想．基于此，寻找安全、高效、廉价的气管舒张药物显得尤为重要．克拉霉素分散片是一种大环内酯类抗生素，已有研究表明它具有抗炎、抗氧化、抗高血压和抑制丁酰胆碱酯酶活性等多种作用[6,7,8,9]，克拉霉素分散片除了具有上述作用外，是否能舒张气管，从而作为一种潜在的支气管扩张剂用于治疗气道反应性疾病尚无定论．本实验的意义在于通过离体组织恒温灌流系统和生物机能实验系统来研究克拉霉素对预收缩小鼠气管的舒张作用，探讨克拉霉素治疗气道反应性疾病的机制．

　　1、 材料与方法

　　1.1、 仪器与试剂

　　HV-4型离体组织器官恒温灌流系统 (成都泰盟科技有限公司) ;JH-2型张力换能器 (成都泰盟科技有限公司) ，PHS-2F型pH计 (上海精科公司) ，HW-1000型磁力搅拌器 (金坛市瑞华仪器有限公司) ，EL-104型电子天平 (瑞士梅特勒-托利多公司) ;克拉霉素分散片 (哈药集团制药六厂) ;Y27632、硝苯地平和4-羟乙基哌嗪乙磺酸 (HEPES) 均购自美国sigma公司;乙醇 (分析纯) 、氯化钠 (分析纯) 、氯化钾 (分析纯) 、氯化钙 (分析纯) 、葡萄糖 (分析纯) 、六水氯化镁 (分析纯) 均购自上海国药集团化学试剂有限公司．高钙溶液 (PSS (mmol/L) ) :135 NaCl, 5 KCl, 2 CaCl2, 10葡萄糖，10 HEPES, 1 MgCl2·6H2O, p H调为7.2．高钾溶液:在PSS溶液基础上加入75 mmol/L KCl.

　　1.2、 实验动物

　　SPF级雄性昆明小白鼠22只，812周龄，购自湖北省疾病预防控制中心．动物实验和处理均遵照《中南民族大学实验动物使用与福利指导手册》．小鼠饲养温度为2024℃，湿度为40p%，小鼠能够自由饮水进食．每隔一天添料、加水1次，1周换12次垫料．

　　1.3、 实验方法

　　1.3.1、 克拉霉素分散片母液的配制

　　将克拉霉素分散片充分研磨成粉，然后用电子天平上准确称量0.3 g克拉霉素分散片粉末，加入3 m L高钙液使其溶解，从而制成100 mg/m L的母液．

　　1.3.2、 张力换能器试验系统调试

　　首先打开氧气阀门，调节供氧量在合适范围，同时打开恒温控制系统并调至温度为37.0℃，向每个浴槽加入6 m L高钙溶液，最后打开张力换能系统，输入信号设为张力，调节负荷单位为“mg”，设置张力采样率为“100 Hz”.

　　1.3.3、 气管环的制备

　　小鼠饲养48 h后，采用脊椎脱臼法处死[10]，然后用大头针将口腔和四肢钉在解剖板上，腹部喷洒75%的酒精后，从小鼠的胸腹部剪开皮肤至下颚，再从正中间剪开肋骨，暴露胸腔内部，除去心脏及其余组织，取出完整的气管与肺组织，浸泡在预冷的高钙溶液中，用维纳斯剪与镊子精准地剪去食管及其余组织，从而分离出气管，剪成长约34 mm的气管环．小鼠气管环张力测定方法与文献报道基本相同[11]．将分离获得的气管环套入张力换能器的挂钩中，置于通氧的恒温水浴槽中，然后将气管环前负荷调至300 mg，使组织预平衡1 h．平衡期间，每15 min换高钙溶液1次，共换液4次．完成气管环平衡之后，用100 mmol/L ACh对气管进行预刺激3次，使气管处于最佳收缩状态，待气管休息20min后再次开始正式试验．

　　1.3.4、 克拉霉素分散片舒张浓度实验

　　气管环经平衡后，向灌流槽中加入100 mmol/L ACh，刺激气管使其收缩到达最大值进入平台期，然后加入不同体积的克拉霉素母液，使灌流槽中的克拉霉素浓度依次达到10-2.0, 10-1.5, 10-1.0, 10-0.5, 100, 100.5, 100.75, 101.0mg/m L (此浓度依据临床使用量和预实验浓度) ．观察记录不同浓度克拉霉素对于气管的舒张作用，确定克拉霉素的最佳浓度．

　　1.3.5、 克拉霉素分散片对高钾溶液预缩气管的影响

　　气管环经平衡后，向灌流槽中加入80 mmol/L高钾溶液收缩气管环，刺激气管使其收缩进入平台期，然后加入最佳浓度的克拉霉素，读取肌张力数值．

　　1.3.6、 克拉霉素分散片对硝苯地平舒张气管的影响

　　气管环经平衡后，向灌流槽中加入100 mmol/L ACh，刺激气管使其收缩进入平台期，然后加入10μmol/L硝苯地平舒张气管环，待舒张作用稳定后，加入最佳浓度的克拉霉素，读取肌张力数值．

　　1.3.7、 克拉霉素分散片对Y27632舒张气管的影响

　　气管环经平衡后，向灌流槽中加入100 mmol/L ACh，刺激气管使其收缩进入平台期，然后加入30μmol/L Y27632舒张气管环，待舒张作用稳定后，加入最佳浓度的克拉霉素，读取肌张力数值．

　　1.3.8、 统计学方法

　　所有数据均由平均数!标准误表示．组间数据差异显着性采用ORIGIN 9.0软件Student T检验法进行统计分析．P<0.05视为差异性显着．

　　2、 结果与分析

　　2.1、 克拉霉素分散片舒张浓度实验

　　如图1a所示，ACh可以引起小鼠气管环的急剧的强收缩，肌张力为 (11.15±0.38) m N，随着不同浓度克拉霉素的加入，预收缩的气管环逐渐发生舒张，肌张力降至 (5.11±0.45) m N (P<0.05) ．当灌流液体中克拉霉素浓度超过1 mg/m L时，气管环的舒张变得非常明显，且克拉霉素的舒张作用呈现剂量依赖性．由图1b可知随着克拉霉素浓度升高，气管环舒张比率逐渐上升，当克拉霉素浓度为5.62 mg/m L时舒张比率高达55%，此后随着克拉霉素浓度的升高，舒张比率略有降低．由此可以确定克拉霉素最佳效果浓度为5.62 mg/m L.

　　图1 克拉霉素对乙酰胆碱预收缩气管环的浓度依赖性舒张作用

　　图2 克拉霉素对高钾预收缩气管的舒张

　　2.2、 克拉霉素分散片对高钾溶液预缩气管的影响

　　如图2所示，高钾溶液引起了气管环的强烈收缩，肌张力达到 (11.45!0.49) m N．待此收缩达到平台期后，5.62 mg/m L克拉霉素的加入引起气管环的强烈舒张，肌张力降至 (4.85!0.28) m N (P<0.05) .

　　2.3、 克拉霉素分散片对硝苯地平舒张气管作用的影响

　　如图3所示ACh引起气管环的强烈收缩，待收缩达到稳定后，硝苯地平的加入引起了气管环的舒张，肌张力降至 (7.55±0.51) m N，然而克拉霉素的加入引起气管环舒张效果比硝苯地平更强烈，肌张力降至 (4.38±0.56) m N (P<0.05) .

　　2.4、 克拉霉素分散片对Y27632舒张气管作用的影响

　　如图4所示ACh引起气管环强烈而稳定的收

　　缩，Y27632的加入引起气管的舒张，肌张力降至 (6.48±0.46) m N．此后，克拉霉素的加入引起气管发生明显的舒张效果，肌张力降至 (3.86±0.65) m N (P<0.05) .

　　图3 克拉霉素在硝苯地平存在条件下舒张了乙酰胆碱预收缩的气管环

　　图4 克拉霉素在钙敏感通路阻断剂存在条件下舒张了乙酰胆碱预收缩的气管环

　　3、 讨论

　　本实验结果显示克拉霉素对ACh引起的小鼠气管平滑肌的收缩具有剂量依赖性的舒张作用．当克拉霉素浓度为5.62 mg/m L时，舒张比率高达55%，其舒张效果与先前研究的罗红霉素对预收缩气管舒张效果相似[11]．当高钾溶液引起气管平滑肌细胞膜的去极化，激活电压依赖性L型钙离子通道，引起胞外钙离子内流，使得胞内钙离子浓度升高，从而触发气管收缩时，克拉霉素的加入使得气管明显舒张，肌张力从 (11.45±0.49) m N降至 (4.85±0.28) m N．这一结果表明克拉霉素能有效舒张ACh和高钾溶液引起的气管平滑肌收缩，推测其机制可能通过阻止气管平滑肌细胞膜上钙离子通道开放，进而减少Ca2 内流，使得收缩的气管舒张．在L型钙离子通道抑制剂硝苯地平存在的条件下，克拉霉素能将气管环肌张力由 (7.55±0.51) m N降低至 (4.38±0.56) m N，表明克拉霉素与硝苯地平联合使用可以增强L型钙离子通道抑制剂发挥促进ACh预收缩气管环舒张的作用，进一步证明克拉霉素舒张气管的作用机制与抑制L型钙离子通道有关．

　　Y27632是Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶 (ROCK) 阻断剂，可以阻止ROCK介导钙敏感性降低引起的平滑肌收缩．当Y27632存在的条件下，克拉霉素的加入使得气管环肌张力由 (6.48±0.46) m N降低至 (3.86±0.65) m N，表明克拉霉素和Y27632联合使用可以增强对钙敏感通路的调节，从而推测推测克拉霉素引起的舒张作用与ROCK通路相关的钙敏感机制有关;即克拉霉素可通过抑制L型钙离子通道和调节钙敏感通路来舒张平滑肌．

　　克拉霉素是大环内酯类抗生素红霉素的衍生物，有研究报道大环内脂类药物有治疗哮喘的作用[12]．此外，有研究表明克拉霉素能显着减少TNP-α的分泌，降低NF-κB的激活，抑制CXCL8等细胞因子的产生[13]，临床常用于治疗衣原体、支原体等感染后引起的呼吸道感染和哮喘等疾病[14,15]．基于克拉霉素已被临床证明具有安全、高效和廉价等优点，其对收缩的气管环有强烈的舒张效果，又常与其他药物联合作用治疗各种呼吸道感染疾病，因此克拉霉素可作为一种潜在的新型而有效的支气管扩张剂．

　　参考文献

　　[1] 冯晓凯．我国支气管哮喘患病情况及相关危险因素的流行病学调查[D]．北京:北京协和医学院，2014.
　　[2]钟南山．我国支气管哮喘防治研究重点及努力方向[J]．中华结核和呼吸杂志，2005 (12) :809-811.
　　[3]郑义珊，刘素月．支气管扩张合并哮喘的临床特点及其治疗的探讨[J]．中国医药指南，2010 (17) :17-18.
　　[4]张成博．哮喘病的古代中医文献研究[J]．山东中医药大学学报，2005 (5) :376-379.
　　[5]吴锦林，李虎进，任毅．哮喘和COPD的鉴别诊断[J]．现代临床医学，2009 (4) :248-250.
　　[6]郭瑞臣，王本杰，徐维芬，等．克拉霉素分散片与克拉霉素片人体生物利用度比较研究[J]．中国临床药理学与治疗学杂志，1999 (3) :202-205.
　　[7]徐鹏久，刘楠，张姝，等．克拉霉素分散片的健康人体生物等效性研究[J]．中国新药杂志，2008 (11) :975-978.
　　[8]周国栋，曾德志，周红．克拉霉素分散片治疗轻症小儿支原体肺炎80例报告[J]．武汉大学学报 (医学版) ，2012 (1) :130-133.
　　[9]Nakamura M, Wada H, Honda K, et al. Clarithromycin ameliorates pulmonary inflammation induced by short term cigarette smoke exposure in mice[J]. Pulm Pharmacol Ther, 2015, 35:60-6.
　　[10]Jiang Q J, Chen W, Dan H, et al. Cortex phellodendriextract relaxes airway smooth muscle[J]. Evid Based Complement Alternat Med, 2016, 2016:8703239.
　　[11]于孟飞，王倩，刘松青，等．罗红霉素对小鼠乙酰胆碱预收缩气管环的舒张作用[J]．山东医药，2017, 57 (26) :38-40.
　　[12]田野，鲍一笑．大环内脂类药物非特异性抗炎特性及治疗哮喘作用机制[J]．中国实用儿科杂志，2012, 27 (8) :633-635.
　　[13]Mercado N, Hakim A, Kobayashi Y, et al. Restoration of corticosteroid shensitivity by p38 mitogen activated protein kinase inhibition in peripheral blood mononuclear cells from severs asthma[J]. PLo S One, 2012, 7 (7) :e41582.
　　[14]刘春，邓述恺．克拉霉素对烟雾暴露哮喘小鼠肺组织中组蛋白去乙酰化酶2及糖皮质激素受体α表达的影响[J]．中国抗生素杂志，2017, 42 (2) :154-159.
　　[15]王毅，张淑立，曲彦．克拉霉素治疗非嗜酸性粒细胞型难治性哮喘的疗效分析[J]．临床肺科杂志，2012, 17 (11) :1948-1951.